物語は鹿目まどかが巨大な怪物に破壊された市街地で傷つきながら戦う少女暁美ほむらを目撃し、白い動物のような生き物キュゥべえから「僕と契約して、魔法少女になってほしい」と告げられる夢を見るところから始まる。そのすぐ後にほむらはまどかと同じクラスに転校生として現れ、ほむらはまどかに「魔法少女になってはならない」と警告を行う。そして第1話後半ではまどかと友人の美樹さやかが魔女の結界に迷い込み、2人はそこで魔法少女の巴マミと出会う。
マミに救われたまどかとさやかは、キュゥべえからは魔法少女になるよう勧誘を受け、マミからは魔法少女の存在と魔女の脅威についての説明を受ける。2人はマミと接することで、魔法少女になることに強い憧れを抱くが、まもなくマミは魔女との戦いに敗れ、むごたらしい最期を迎える。マミの死にまどかの魔法少女に対する想いが揺らぐ一方で、さやかはキュゥべえと契約して魔法少女となり、さらに見滝原には別の魔法少女、佐倉杏子がやってくる。
第6話では、それまで魔法少女の魔力の源としか思われていなかった「ソウルジェム」の実態が明らかになる。ソウルジェムは魔法少女の本体ともいえる器官であり、契約の際にキュゥべえによって契約者の肉体から抽出された魔法少女の魂そのものであった。そのため、肉体との距離が100mの範囲を越えると肉体は機能を停止して死体と同様になってしまい、物理的に破壊されると魔法少女は完全に死亡するということが、はからずも発覚する。一方でキュゥべえは、魔法少女は魂と肉体の分離によって痛覚が緩和される上、ソウルジェムが無事である限り理論上は不死身の身体を得るという戦いにおける利点を説明するが、魔法少女からは一様に嫌悪感を示される。
第7話で、さやかは自己嫌悪による葛藤で自暴自棄に陥っていく。一方で、当初はさやかと対立していた杏子は態度を軟化させ、さやかに過去の自分を重ねて心を寄せていくが、杏子の想いとは裏腹に、第8話でさやかのソウルジェムは絶望で濁りきり、杏子の目の前で魔女と化す。そしてこのさやかの魔女化をきっかけに、魔法少女の魂は憎悪や絶望などの暗い情念が蓄積することでも穢れを溜め込み、濁りきると魔女を孵化させることが明らかになる。キュゥべえの正体はインキュベーターと呼ばれる地球外生命体の端末であり、魔法少女が魔女となることは彼らによって仕組まれたことであった。キュゥべえたちの種族の目的は宇宙の寿命を延ばすことにあり、魔法少女たちが希望から絶望へ相転移して魔女となる際に、その感情が熱力学第二法則に縛られない莫大なエネルギーを発生させるため、そのエネルギーを搾取するために魔法少女は生み出されていた。
第9話で杏子はさやかを元に戻そうとするが、いったん魔女化した魔法少女を戻すことはできず、魔女化したさやかと共に命を落とす。そして第10話では、最強の魔女「ワルプルギスの夜」の襲来を前に、見滝原に現存するただ一人の魔法少女となったほむらの素性や目的が明らかにされる。ほむらは異なる時間軸からやってきた時間遡行者であり、元の時間軸において「ワルプルギスの夜」に殺されてしまったまどかが助かる未来への道筋を求めて、平行世界の同じ時間を繰り返し戦い続けてきたのであった。しかし、その行為は結果としてまどかを最強の魔法少女にして最悪の魔女となる素質を与えることに繋がっていた。
第11話で、まどかはキュゥべえと契約することを決意する。そして最終話で告げられたまどかの願いにより、魔女を生み出すルールそのものが覆され、「ワルプルギスの夜」は消滅し、本来なら魔女化するはずであったまどか自身も消滅し、宇宙は新たな法則によって再構成される。
新たに構成された世界では、魔法少女が魔女になることはなくなり、力を使い果たした際は心安らかなままソウルジェムとともに消滅し、その魂はまどかの導きで別の宇宙へと転送されるというシステムに変化していたが、魔女に代わり魔法少女の敵として魔獣が現れていた。改変前の世界で戦死したマミ、杏子も存命しているが[注 7]、まどかの存在は彼女の家族を含む人々の記憶から消えている。最後に戦い続けるほむらの姿が描かれて、物語の幕は閉じる。
She has a loving family and best friends, laughs and cries from time to time… Madoka Kaname, an eighth grader of Mitakihara middle school, is one of those who lives such a life. One day, she had a very magical encounter. She doesn't know if it happened by chance or by fate yet. This is a fateful encounter that can change her destiny- This is a beginning of the new story of the magical witch girls-
